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甲胎蛋白时间分辨荧光免疫分析
时间:2015-09-06    来源:未知    作者:admin
 

  近年发展的时间分辨荧光测量技术以稀土离子为示踪材料,具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点。我们采用时间分辨荧光测量技术,建立了AFP时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)。
 
  一、材料与方法
 
  1. 材料与试剂:抗AFP单克隆抗体A137和A47由无锡市第二制药厂提供。Eu3+标记盒、Eu3+发光增强液、AFP TRFIA药盒和AFP参考标准,EG-G-Wallac产品。CA199、CA125和CA153参考标准,CIBACORNING产品。AFP质量控制血清(L:21~35μg/L;M:62~93μg/L;H:173.4~260.2μg/L),中国药品生物制品鉴定所产品。全自动TRFIA检测仪(Auto DELFIA 1235)为EG-G-Wallac产品。
 
  2. 固相抗体制备:将A47单抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3
 
  pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液,微孔板各孔加200μl,4℃放置过夜。BSA封闭后真空抽干,板条密封后置-20℃冷冻保存。
 
  3. Eu3+-A137制备:参照Eu3+标记盒说明书操作。取溶解于0.155mol/L
 
  NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH8.5缓冲液A137(2g/L)500μl加入含0.2mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)冻干粉的小瓶中,30℃磁力搅拌反应20h。反应液经用80mmol/L
 
  Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1cm×40cm)层析,A280监测收集蛋白峰。
 
  4. 测定方法:采用平衡法建立AFP-TRFIA,即在包被有A47的96孔微孔板上,每孔依次加入25μl AFP参考标准或待测血清,200μl以反应缓冲液1:1000稀释的Eu3+-A137,25℃振荡孵育1h后,用洗涤液洗涤6次。再加增强液200μl,25℃振荡反应5min,荧光检测。全部过程均在Auto
  DELFIA 1235上自动完成,软件设置由本所自编。
 
  5. 数据分析和统计处理:AFP-TRFIA标准曲线由Auto DEFIA 1235自带的Log-Logit函数处理。精密度图和可测范围分析用吴德福IRMA数据处理软件。统计学处理用t 检验。
 
  二、结果
 
  1.Eu3+-A137的理化和免疫学鉴定:Eu3+-A137以EG-G-Wallac提供的Eu3+标准为参考,平均每个A137 IgG上连接了7.52个Eu3+,产率达53.07%。选择AFP参考标准高点(1000μg/L),Eu3+-A137 1:1000稀释,进行TRFIA,Bmax/T为6.65%,与低点(1μg/L)的发光计数差达2个数量级以上。被测物和反应发光计数基本成算术级数正比关系。
 
  2.AFP-TRFIA的考核:经Log-Logit函数处理程序处理得AFP-TRFIA标准曲线。(1)方法的特异性:将CEA、CA199、CA125和CA153分别配成10~500U/ml、15.8~409U/ml、12.1~732U/ml和27.7~243U/ml一系列不同浓度,代替标准曲线中的AFP参考标准。在上述浓度范围内,CEA、CA199、CA125和CA153对AFP-TRFIA均无交叉反应。(2)精密度和回收率:本方法的批内和批间CV分别为1.59%和7.14%,8批标准曲线的ABCV均小于0.0114,精密度图显示可测范围为4.22~1210μg/L,回收率为103.98%。(3)灵敏度和稳定性:以零剂量点发光值均值加2s后的发光值在标准曲线上得到的相应值为0.43μg/L。8条不同时间进行的AFP-TRFIA的效点均值ED20、ED50和ED80分别为(4.25±0.21)μg/L、(35.59±0.19)μg/L和(246.90±0.96)μg/L。
 
  三、讨论
 
  TRFIA测量仪已进入第三代,分析技术已实现高度自动化。我们所建方法适于测量血清AFP的含量,Eu3+-A137经标准曲线比较鉴定,免疫反应性基本无损失;其冻干品-30℃保存13个月后免疫反应参数基本未改变。用国家指定的AFP质控血清作样品进行分析,L、M和H分别为28.0μg/L、77.5μg/L和216.8μg/L,符合质控要求。我们曾把高含量的AFP血清样品经1:10~1000稀释后用于本方法的测定,换算后的AFP含量非常接近;用该系列稀释血清代替AFP参考标准作标准曲线,其斜率与AFP的标准曲线斜率基本一致,表明AFP-TRFIA有良好的健全性,血清基质对本方法没有明显影响。8孔重复4组参考标准点的ABCV均<0.06,批内及批间重复性研究亦证明本方法是可靠的。以往超微量免疫分析技术每次分析,即使单样品检测也必须做标准曲线作相对测量的依据。我们建立的AFP-TRFIA同批试剂连续5个月应用分析,发现标准曲线基本重合,无明显漂移,可以用同批试剂单次标准曲线为今后分析的固定参考。这既可减轻临床应用的工作强度,又可提高药盒的经济价值。
 
  AFP-TRFIA受检血清用量仅为RIA或IRMA的四分之一,有利于减少样品对分析系统的干扰,也有助于节约样品,便于多指标分析。AFP-TRFIA的分析时间仅为1h,且分析系统高度自动化,这样可提高临床检验结果的速度,又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。


( 责任编辑:admin )

 
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